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La TVB n’impose pas d’identifier des connexions entre tous les espaces de biodiversité présents sur un territoire. Il ne s’agit pas de tout connecter « à tout prix » : parfois des écosystèmes fonctionnent de manière isolée. Les continuités écologiques identifiées doivent pouvoir se justifier écologiquement et relier des espaces qui fonctionnent ensemble.
Toute connexion n’est pas systématiquement positive pour la conservation de la biodiversité compte tenu du fonctionnement des écosystèmes. Les diagnostics préalables à l’identification de la TVB doivent permettre d’évaluer la pertinence de connecter ou de garder l’isolement naturel de certains espaces. Certains réservoirs de biodiversité peuvent faire partie de la TVB sans avoir vocation à être reliés entre eux s’il est démontré la pertinence de l’isolement naturel de ces espaces pour la conservation de la biodiversité, pour limiter la dispersion d’espèces, notamment d'espèces exotiques envahissantes ou pour limiter la propagation de maladies animales et végétales (cf. article R. 371-19 du code de l’environnement).